多肽介导的仿生二氧化硅纳米粒子的制备方法及应用

权利要求书： 1.一种多肽介导的仿生二氧化硅纳米粒子的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤1：采用ITC纯化法制备高纯度的类弹性蛋白多肽ELPs；ITC纯化法具体包括：首先对ELPs溶液加热使之发生相变，在高于Tt条件下离心去收集沉淀；接着，用预冷的缓冲液溶解沉淀，在低温条件下离心，对离心后的沉淀进行复性处理，收集上清，此即为纯化的类弹性蛋白多肽ELPs；

步骤2：类弹性蛋白多肽ELPs介导二氧化硅粒子沉淀，获得仿生二氧化硅纳米粒子；具体包括如下过程：

将步骤1得到的类弹性蛋白多肽ELPs溶解于PBS缓冲液得到ELPs溶液，类弹性蛋白多肽ELPs的浓度范围为10μmol/L?100μmol/L，pH=6.9?7.1；

由SiO2前体溶解于溶液中配制硅源溶液，SiO2前体是四甲基硅烷或者四乙基硅烷；

将体积为a的ELPs溶液与体积为b的硅源溶液混合，a：b=（9?11）：1；

混合均匀后在室温下静置预设时间，高速离心收集二氧化硅沉淀，即得到仿生二氧化硅纳米粒子。

2.根据权利要求1所述的仿生二氧化硅纳米粒子的制备方法，其特征在于：硅源溶液配制过程如下：

配制初始硅源溶液：将质量为c的SiO2前体溶于浓度为d的盐酸中，定容v即可获得初始硅源溶液；c单位为克，d单位为mmol/L，v单位为mL；

配制离散石墨溶液：将质量为e的石墨溶于浓度为d的盐酸中，其中，c>5e，定容v，然后进行超声共混获得离散石墨溶液；e单位为克；

然后将初始硅源溶液和离散石墨溶液混合并高速搅拌预设时间，即可得到混合后的硅源溶液。

3.根据权利要求2所述的仿生二氧化硅纳米粒子的制备方法，其特征在于：其中混合后的硅源溶液通过如下过程获得：将石墨加入盐酸，进行超声搅拌预设时间，得到悬浊液，然后将悬浊液和初始硅源溶液快速混合，在35?60℃进行搅拌预设时间，即可得到混合后的硅源溶液。

4.根据权利要求2所述的仿生二氧化硅纳米粒子的制备方法，其特征在于：得到的仿生二氧化硅纳米粒子的尺寸为70nm至400nm，仿生二氧化硅纳米粒子中二氧化硅的质量百分比为10%?99%。

5.根据权利要求2所述的仿生二氧化硅纳米粒子的制备方法，其特征在于：石墨的质量?3

百分比浓度ω范围为3wt%?3.7wt%，ω=质量e*10 /12*v。

6.根据权利要求1所述的仿生二氧化硅纳米粒子的制备方法，其特征在于：步骤1得到的类弹性蛋白多肽ELPs的基因序列为ELP[K8F?s]，ELP[K8F?s]即指连续的10个PGXG五肽单元中，每个五肽的第4位Xaa有1个赖氨酸（K）、8个缬氨酸（）、1个苯丙氨酸（F），s即指有s个以PGXG为单元的重复序列，s的取值为10?300。

7.根据权利要求1所述的仿生二氧化硅纳米粒子的制备方法，其特征在于：步骤1中，对离心后的沉淀进行复性处理具体包括：首先对沉淀在温度?18℃至0℃范围内进行快速脱水处理，并对脱水处理后的沉淀进行适度震碎，获得固态颗粒物，然后对该固态颗粒物进行过筛、风选或者高压静电吸附，将大部分包涵体去除，获得复性后的沉淀。

8.根据权利要求7所述的仿生二氧化硅纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述复性处理还包括：将复性后的沉淀在低温下折叠复性以减少蛋白质聚集的形成，当形成聚集体的中间体已经减少时，迅速将温度提高10度，以促进蛋白质折叠复性，从而可获得高复性效率的固态颗粒；低温是指?18℃至?10℃。

9.一种由权利要求1?8任一制备方法得到的仿生二氧化硅纳米粒子的应用，所述仿生二氧化硅纳米粒子用于酶的自固定化。

10.权利要求1?8任一制备方法得到的仿生二氧化硅纳米粒子在制备缓释药物载体中的应用。

说明书： 一种多肽介导的仿生二氧化硅纳米粒子的制备方法及应用技术领域[0001] 本发明涉及借助生物的方法人工合成特定纳米结构的无机材料，具体是一种仿生二氧化硅纳米粒子的制备，尤其是基于多肽介导的仿生二氧化硅纳米粒子的制备方法。

背景技术[0002] 在自然界中存在着一种很普遍的现象——生物矿化。在生物矿化现象中，二氧化硅占了较大一部分，其广泛存在于如海绵、细菌、单细胞藻类、高等植物和原生动物中等等。

科学家经深入的研究发现，相较于人工合成技术所产生的二氧化硅，这些生物二氧化硅具

有前者所难以实现的特定功能和复杂的结构。除此之外，该种生物矿化过程属于非常典型

的绿色低耗能合成技术，因其在相对温和的条件下形成，不需要传统合成技术的高温、高压

和极端pH值等较为苛刻的合成条件。

[0003] 生物矿化的另一个重要特征是：有机物可以以自组装有机聚合体或是使用生物大分子模板来合成如纳米级别精细的结构的有机、无机复合材料，科学家可遵循该特征来合

成具有功能多样和形态复合的无机材料。因此，该类研究方向在材料化学研究领域中也占

据了重要的一部分，以合成高分子有机物为模板或是模拟生物分子引导无机材料(例如二

氧化硅)至新结构来制造有机分子涂层或合成纳米材料，该种方式在仿生领域等方面有着

优异的应用前景。

[0004] 生物矿化过程中，生物大分子(生物体含有一些具有特殊功能或结构的蛋白质等有机大分子)功能性基团的界面处会发生一些功能性的有机大分子和无机物离子之间的相

互作用，即生物矿物为何具有特殊的组装方式和异常的精细结构，是因该类功能性大分子

借助自身的功能基团从纳米尺度上对无机矿物的结构和形态进行了调控，也就是说，蛋白

质等有机物质在生物矿化过程中起到了相当重要的调控作用。

[0005] 受自然界中海洋真核生物硅藻类和海绵体的硅矿化过程，现有技术中采用从生物体提取的活性分子(如silaffins)、合成的胺类分子或大分子、多肽以及蛋白质，合成仿生

二氧化硅，例如申请号为200610124462.X的功能性仿生二氧化硅纳米粒子及其制备方法，

其采用阳离子聚胺微凝胶作为功能性模板，使二氧化硅在环境条件下原位仿生沉积，得到

阳离子聚胺/SiO2杂化的功能性纳米粒子。其中，其使用的功能性模板无法被反复使用，因

此该二氧化硅纳米粒子的制备过程较为复杂，增加了其实现成本。

[0006] 为此，现有技术此基础上研究出了一种类弹性蛋白多肽(ELPs)来替代现有的功能性模版，该类弹性蛋白多肽是一类由al?Pro?Gly?Xaa?Gly(PGXG)五肽重复单元序列串联

组成的人工聚合物，其中，Xaa可以是除脯氨酸(Pro)外的任何氨基酸，多为赖氨酸、缬氨酸、

苯丙氨酸。该类弹性蛋白多肽(ELPs)在以下发明人所公开发表的文献中均有提到：[1]黄凯

宗，李晶晶，李巍，葛慧华，王文研，张光亚.类弹性蛋白多肽的从头设计、非色谱纯化及盐效

应[J].生物工程学报，2011，27(4)：653?658.[2]付晓平，王文研，张光亚.以类弹性蛋白多

肽为标签的表达质粒构建及其用于木聚糖酶的非色谱纯化[J].微生物学报，2012，52(1)：

90?95.[3]李存存，张光亚.酶定向固定化方法及应用的研究进展[J].化工进展，2013，32

(10)：2467?2474.[4]发明人在先申请的申请号为201010562100.5的发明专利公开的一种

能对目标蛋白进行非色谱分离的融合标签蛋白及其编码基因和制备方法。

发明内容[0007] 在下文中给出了关于本发明实施例的简要概述，以便提供关于本发明的某些方面的基本理解。应当理解，以下概述并不是关于本发明的穷举性概述。它并不是意图确定本发

明的关键或重要部分，也不是意图限定本发明的范围。其目的仅仅是以简化的形式给出某

些概念，以此作为稍后论述的更详细描述的前序。

[0008] 根据本申请的一个方面，提供一种多肽介导的仿生二氧化硅纳米粒子的制备方法，其包括：

[0009] 步骤1：采用ITC纯化法制备高纯度的类弹性蛋白多肽ELPs；[0010] 此步骤中，现有技术的ITC纯化法一般是如下过程：首先对ELPs溶液加热使之发生相变，在高于Tt条件下离心去收集沉淀；接着，用预冷的缓冲液溶解沉淀，在低温条件下离

心，收集上清，此即为纯化的ELPs；重复上述ITC纯化过程，直至纯化后的ELPs达到纯度；其

中，ITC纯化过程所需的次数，因目的蛋白及ELPs的不同会有差异，通常经过2～5次ITC纯化

过程即可获得较高纯度的蛋白；

[0011] 本发明采用改进的ITC纯化法来实现快速制备高纯度的类弹性蛋白多肽ELPs。其原理是，由于能量传递和局部产热等原因，很难用于大体积细胞悬液的破碎，这样部分未破

碎细胞与包涵体混在一起，给后期纯化带来困难，为降低离心后收集的沉淀中的包涵体，本

申请对离心后的沉淀进行复性处理，降低无活性的固体颗粒的比例，从而提高纯化速度。其

中，对离心后的沉淀进行复性处理具体包括：首先对沉淀在低温下(约?18℃至0℃)进行快

速(10秒内)脱水处理，并对脱水处理后的沉淀进行适度震碎(可用超声震碎)，获得固态颗

粒物，然后对该固态颗粒物进行过筛、风选或者高压静电吸附(利用变性盐结晶比重)，将大

部分包涵体去除，获得复性后的沉淀。上述脱水处理过程需要快速而短暂且在低温下进行，

可避免影响复性后的蛋白的稳定性以及活性。上述过程作为第一次的复性处理，优选的复

性过程还包括第二次的复性处理：将第一次的复性处理后的固态颗粒物在低温(约?18℃

至?10℃)下折叠复性以减少蛋白质聚集的形成，当形成聚集体的中间体已经减少时，迅速

将温度提高约10度左右(保证提高温度后的温度仍小于0度)，以促进蛋白质折叠复性，从而

可获得高复性效率的固态颗粒。特殊情况下，上述第二次复性处理可以执行2次(一般一次

即可)以进一步提高复性效率。同时，第二次的复性处理还可以是以复性溶液来复性的方

案，例如将固态颗粒物缓慢加入混合了铜离子的复性溶液(一般的缓冲液平衡液，例如十二

烷基硫酸钠溶液、磷酸缓冲盐溶液PBS等)，在特定温度(例如25?35℃)下反应预设时间(例

如1小时)，再加入抑制剂、复性剂等终止反应，最后对该溶液进行离心获得沉淀。一般说来，

蛋白质的复性效率在20％左右，本申请的复性效率可达60％。

[0012] 本申请在现有技术的基础上增加了对沉淀的复性处理过程，大大提高了纯化速度，实验证明，现有技术的方案需要经过2～5次ITC纯化过程来获得较高纯度的蛋白，使用

本申请的方案，只需要1次即可达到所需的纯度。不仅如此，上述复性处理后产物为固态颗

粒物(比原来的沉淀物的粒径更小)，具有很好的分散性，更有利于其在步骤2混合溶液的分

散和溶液充分接触反应，加快反应速度。此外，增加复性过程的方案与现有技术的方案相

比，由于其活性蛋白变多，在后续的二氧化硅的制备过程中获得了非常好的促进作用。

[0013] 步骤2：类弹性蛋白多肽ELPs介导二氧化硅粒子沉淀，获得仿生二氧化硅纳米粒子；具体包括如下过程：将步骤1得到的类弹性蛋白多肽ELPs溶解于PBS缓冲液得到ELPs溶

液，类弹性蛋白多肽ELPs的浓度范围为10μmol/L?100μmol/L，pH＝(6.9?7.1)；由SiO2前体

溶解于溶液中配制硅源溶液，SiO2前体可选四甲基硅烷或者四乙基硅烷；将体积为a的ELPs

溶液与体积为b的硅源溶液混合，a∶b＝(9?11)∶1；混合均匀后在室温下静置预设时间

(5min)，高速离心(10,000rpm，离心3min)，收集二氧化硅沉淀，即可得到二氧化硅/ELPs复

合材料(仿生二氧化硅纳米粒子)。

[0014] 现有的多肽介导二氧化硅粒子沉淀获得的仿生二氧化硅纳米粒子很难形成规则的球形，这是因为SiO2是一种空间立体网状结构，每一个硅原子与周围的四个氧原子形成

一个Si、O正四面体，即硅原子位于正四面体的中心，四个氧原子位于正四面体的四个顶点

上，每一个氧原子参与形成2个Si、O正四面体，即每一个硅原子与周围的四个氧原子可以形

成四个Si?O单键，而在微观结构上，其在硅源溶液中很容易发生团聚现象，容易产生聚集，

那么在硅源溶液与ELPs溶液混合时，无法充分混合，因此最终获得的二氧化硅纳米粒子常

常受到干扰而无法获得规则的球形。因此，本申请为了改进上述问题，针对此步骤同样进行

了改进，对硅源溶液进行改进，改进过程如下：配制硅源溶液：将质量为c(单位为克)的SiO2

前体(例如四甲基硅烷TMOS)溶于浓度为d(单位为mmol/L)的盐酸中，定容v(单位为mL)即可

获得硅源溶液；配制离散石墨溶液：将质量为e(单位为克)的石墨溶于浓度为d(单位为

mmol/L)的盐酸中，其中，c＞5e，定容v(单位为mL)，然后进行超声共混获得离散石墨溶液；

然后将硅源溶液和离散石墨溶液混合并高速搅拌预设时间，即可得到混合硅源溶液；其中

混合硅源溶液优选通过如下过程获得：将石墨加入盐酸，进行超声搅拌预设时间(至少3小

时)，得到悬浊液，然后将悬浊液和硅源溶液快速(几秒内)混合，在35?60℃进行搅拌预设时

间(一般要超过30min)，即可得到混合硅源溶液。

[0015] 其中，石墨的空间结构是一种层状结构，在每一层中，每一个碳原子参与形成3个平面正六边形，通过将石墨的层状结构将SiO2的立体网状结构进行分散化，使其大大减少

团聚现象，因此当硅源溶液与ELPs溶液混合时，可实现充分混合，进而可获得规则的球形结

构的仿生二氧化硅纳米粒子。同时，通过扫描电镜与透射电镜观察二氧化硅粒子的大小和

形貌，得到二氧化硅粒子呈规则的球形，粒子直径大小集中在70nm至400nm之间。

[0016] 此外，混合硅源溶液由于加入了石墨，ELPs溶液与混合硅源溶液混合后获得的二氧化硅沉淀里面有石墨，为此，根据石墨导电而二氧化硅不导电，可通过配制电解液并通电

(在电解液中插入两个电极，用电源在两电极间加上一定的电压时，石墨被吸附至电极，然

后电解液的最终沉淀物即是仿生二氧化硅纳米粒子)，上述电解液的配制以及通电过程本

领域的技术人员可参阅相关材料获得，例如格拉斯通著，贾立德等译：《电化学概论》，科学

出版社，北京，1958。(S.Glasstone，AnlntroductiontoElectrochemistry，an

Nostrand，NewYork，1947.)，本文不再赘述。

[0017] 此外，在实验条件下，并不是离散石墨溶液中石墨的质量越高最后获得的二氧化?3

硅粒子的粒子越多、形态越好，石墨的质量百分比浓度ω，ω＝质量e*10 /12*v(石墨的摩

尔质量为12g/mol，离散石墨溶液体积质量浓度＝(石墨的摩尔质量×mmol/1000)/l＝g/

l)，通过对实验数据进行拟合，得到石墨的质量百分比浓度ω优选为3wt％?3.7wt％，也可

表达为5.5e＜c＜7e。

[0018] 优选的，上述生成的类弹性蛋白多肽ELPs的氨基酸序列为ELP[K8F?s]，ELP[K8F?s]即指连续的10个PGXG五肽单元中，每个五肽的第4位Xaa有1个赖氨酸(K)、8个缬氨酸

()、1个苯丙氨酸(F)，s即指有s个以PGXG为单元的重复序列。类弹性蛋白多肽ELPs是一种

能应答温度变化的人造基因工程蛋白，它包含数个重复序列(PGXG)n，其中X代表除脯氨酸

以外的任一氨基酸，不同X的设计组合能产生性能各异的ELPs。根据本申请的实验验证以及

推论，其他带有类似氨基酸的ELPs序列也可以实现本申请的介导作用，且重复数s的变化范

围为10???300。例如s＝40，则ELPs记为ELP40，其基因序列则为ELP[K8F?40]，ELP[K8F?40]

即指连续的10个PGXG五肽单元中，每个五肽的第4位Xaa有1个赖氨酸(K)、8个缬氨酸()、1

个苯丙氨酸(F)，40即指有40个以PGXG为单元的重复序列。

[0019] 根据本申请的另一方面，提供一种由上述方法得到的仿生二氧化硅纳米粒子的应用，其中，所述仿生二氧化硅纳米粒子用于酶的自固定化。

[0020] 根据本申请的再一方面，提供一种由上述方法得到的仿生二氧化硅纳米粒子的应用，所述仿生二氧化硅纳米粒子作为的缓释药物的载体。

[0021] 本申请通过上述方案，与现有技术相比，具有如下优势：[0022] 1、类弹性蛋白多肽ELPs采用ELP40(发明人在先申请的申请号为201510042517.1的发明专利公开的一种蛋白质分子量标准的制备方法已公开其基因序列)实现，ELP40在反

应前后都能保留其相变的性质，因此最后获得的ELP?二氧化硅杂化材料比传统的化学或者

生物法合成的二氧化硅有更为广阔的应用前景。此外，由实验过程可知，ELP40既是催化二

氧化硅的形成的催化剂，其本身又被包埋固定在自己催化形成的二氧化硅载体上，该反应

过程既是二氧化硅形成的过程，又是ELP40自催化固定化的过程，该反应条件温和、设备简

单、操作方便、容易达到工业化规模，具有重要的工业应用价值和巨大的应用潜力；工业上，

可以应用于固定化酶领域；生物医学方面，可以作为良好的药物载体，尤其是缓释药物，具

有非常好的应用前景。

[0023] 2、在ITC纯化过程中，增加了对沉淀的复性处理，大大提高了纯化速度，现有技术的方案需要经过2～5次ITC纯化过程来获得较高纯度的蛋白，实验证明，使用本申请的方

案，只需要1次即可达到所需的纯度；不仅如此，上述复性处理后产物为固态颗粒物(比原来

的沉淀物的粒径更小)，具有很好的分散性，更有利于其在步骤2混合溶液的分散和溶液充

分接触反应，加快反应速度。此外，增加复性过程的方案与现有技术的方案相比，由于其活

性蛋白变多，在后续的二氧化硅的制备过程中获得了非常好的促进作用；

[0024] 3、对于类弹性蛋白多肽ELPs介导二氧化硅粒子沉淀中，对硅源溶液进行改进使其与离散石墨溶液超声混合，在微观结构上由石墨的层状结构阻止二氧化硅的立体网状结构

的相互聚集，使二氧化硅粒子的间距变大，且其堆砌的更加疏松，这种疏松的结构可以使得

SiO2前体与ELPs溶液的其他分子充分接触，以形成疏松的网状结构，因此当改进后的硅源

溶液与ELPs溶液混合时，可实现充分混合，进而可获得规则的球形结构的仿生二氧化硅纳

米粒子(且粒径分布更集中，粒子直径大小在70nm至400nm之间，现有技术的粒径一般在几

十纳米到几十微米之间)；

[0025] 4、此外，在对硅源溶液进行改进过程中，还通过对实验数据进行拟合，得到石墨的质量百分比浓度ω优选为3wt％?3.7wt％，也可表达为5.5e＜c＜7e，此种情况下获得更佳

的仿生二氧化硅纳米粒子，形状更为规则，粒径更加集中。

附图说明[0026] 本发明可以通过参考下文中结合附图所给出的描述而得到更好的理解。所述附图连同下面的详细说明一起包含在本说明书中并且形成本说明书的一部分，而且用来进一步

举例说明本发明的优选实施例和解释本发明的原理和优点。在附图中：

[0027] 图1为ELP40介导形成的二氧化硅粒子SEM分析；[0028] 图2a为ELP40介导形成的二氧化硅粒子TEM分析示意图一；[0029] 图2b为ELP40介导形成的二氧化硅粒子TEM分析示意图二；[0030] 图3为ELP40浓度对二氧化硅沉淀量的影响；[0031] 图4为溶液pH值对二氧化硅沉淀量的影响；[0032] 图5为反应温度对二氧化硅沉淀量的影响；[0033] 图6为反应时间对二氧化硅沉淀量的影响；[0034] 图7为二氧化硅粒子中释放的ELP40SDS?PAGE分析；[0035] 图8为蛋白ELP40表达及纯化的SDS?PAGE分析。具体实施方式[0036] 下面将参照附图来说明本发明的实施例。应当注意，为了清楚的目的，附图和说明中省略了与本发明无关的、本领域普通技术人员已知的部件和处理的表示和描述。

[0037] 本发明提供一种多肽介导的仿生二氧化硅纳米粒子的快速制备方法，其包括：[0038] 步骤1：采用ITC纯化法制备高纯度的类弹性蛋白多肽ELP40；作为一个具体的实例，该过程具体包括：

[0039] 准备工作：清理超净工作台，紫外灭菌20min；氨苄青霉素钠按1∶1000(氨苄青霉素钠∶培养基，v/v)比例，如10mL的培养基加10μL；甘油菌按1∶100(菌种∶培养基，v/v)比例的

接种量加入到LB液体培养基中，如10mL的培养基加100μL的菌种；培养基置于37℃、200rpm

恒温摇床培养10?12h。

[0040] 扩大培养及诱导表达：接种前，清理超净工作台，并紫外灭菌20min；接种：氨苄青霉素钠按1∶1000的比例、活化的菌种按1∶100的比例加入到TB培养基中，如200mL的培养基

加200μL的氨苄青霉素钠和2mL的菌种；扩大培养：将接种好培养基置于37℃、200rpm恒温摇

床培养2?4h，OD600值介于0.6?0.8之间，此时，菌体处于对数生长期；

[0041] 诱导表达：将IPTG按1∶200(IPTG∶培养基，v/v)加入到上述培养基中(如200mL的培养基添加1mL)，将培养基置于37℃、200rpm恒温摇床继续培养24h诱导目的基因过量表达。

[0042] 细胞收集及破碎：将上述培养好的菌液分装于500mL离心管中(不要超过离心管体积的2/3)，4000rpm，常温离心20min；弃掉上清液，按1∶25(PBS缓冲溶液∶菌液，v/v)的比例

加入PBS缓冲溶液，洗涤菌体两次，4℃，10000rpm离心10min，收集细胞；弃掉上清液，按1∶25

(PBS缓冲溶液∶菌液，v/v)的比例加入PBS缓冲溶液，重悬菌液，至于冰浴中进行超声破碎。

超声粉碎条件：功率为300W，超声2s，间隔4s，循环次数为200次，超声时间12min。细胞破碎

液于4℃，10000rpm，离心10min，上清为细胞粗提物。

[0043] 蛋白的ITC纯化：向细胞粗提物中加入固体NaCl(2mol/L)，触发ELPs发生相变，37℃恒温水浴20min后，30℃，10000rpm，离心10min；弃上清液，收集沉淀，对离心后的沉淀进

行复性处理；在复性处理后的沉淀物中加入4℃预冷的PBS缓冲溶液以溶解沉淀的蛋白，先

用移液枪将沉淀吹打起来，充分混匀，4℃冰浴30min(尽可能使沉淀的目标蛋白充分溶解)，

10000rpm，离心10min，收集上清液；最终上清为纯ELP40。蛋白ELP40表达及纯化的SDS?PAGE

分析参见图8。

[0044] 本申请中上述类弹性蛋白多肽ELPs采用ELP40实现，ELP40的基因序列为ELP[K8F?40]，ELP[K8F?40]即指连续的10个PGXG五肽单元中，每个五肽的第4位Xaa有1个赖

氨酸(K)、8个缬氨酸()、1个苯丙氨酸(F)，40即指有40个以PGXG为单元的重复序列。该序

列已进行菌种专利保藏(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC

NO.4185，保藏日期：2010年9月17日)，并在申请号为201010562100.5的发明专利中公开。

[0045] 此步骤中，现有技术的ITC纯化法一般是如下过程：首先对ELPs溶液加热使之发生相变，在高于Tt条件下离心去收集沉淀；接着，用预冷的缓冲液溶解沉淀，在低温条件下离

心，收集上清，此即为纯化的ELPs；重复上述ITC纯化过程，直至纯化后的ELPs达到纯度；其

中，ITC纯化过程所需的次数，因目的蛋白及ELPs的不同会有差异，通常经过2～5次ITC纯化

过程即可获得较高纯度的蛋白。本申请在现有技术上增加了一个对沉淀进行复性处理的步

骤，将现有技术的多次纯化过程缩短为1次即可。

[0046] 其中，对离心后的沉淀进行复性处理具体包括：首先使离心后的沉淀在?12℃温度下在10秒内进行快速脱水处理，并对脱水处理后的沉淀进行适度震碎(可用超声震碎)，获

得固态颗粒物，然后对该固态颗粒物进行过筛、风选或者高压静电吸附(利用变性盐结晶比

重)，将大部分包涵体去除，获得复性后的沉淀。上述脱水处理过程需要快速而短暂且在低

温下进行，可避免影响复性后的蛋白的稳定性以及活性。上述过程作为第一次的复性处理，

优选的复性过程还包括第二次的复性处理：将第一次的复性处理后的固态颗粒物在?12℃

低温下折叠复性以减少蛋白质聚集的形成，当形成聚集体的中间体已经减少时，迅速将温

度提高约10度左右(约2度)，以促进蛋白质折叠复性，最后慢慢恢复室温，从而可获得高复

性效率的固态颗粒。特殊情况下，上述第二次复性处理可以执行2次(一般一次即可)以进一

步提高复性效率。同时，第二次的复性处理还可以是以复性溶液来复性的方案，例如将固态

颗粒物缓慢加入混合了铜离子的复性溶液(一般的缓冲液平衡液，例如十二烷基硫酸钠溶

液、磷酸缓冲盐溶液PBS等)，在特定温度(例如25?35℃)下反应预设时间(例如1小时)，再加

入抑制剂、复性剂等终止反应，最后对该溶液进行离心获得沉淀。一般说来，蛋白质的复性

效率在20％左右，本申请的复性效率可达60％。

[0047] 本申请在现有技术的基础上增加了对沉淀的复性处理过程，大大提高了纯化速度，实验证明，现有技术的方案需要经过2～5次ITC纯化过程来获得较高纯度的蛋白，使用

本申请的方案，只需要1次即可达到所需的纯度。虽然本申请加入了复性过程，然而整个复

性过程简单易于实现，因此，整体比较起来，本申请的方案能更快的实现高度纯化。非常不

仅如此，上述复性处理后产物为固态颗粒物(比原来的沉淀物的粒径更小)，具有很好的分

散性，更有利于其在步骤2混合溶液的分散和溶液充分接触反应，加快反应速度。此外，增加

复性过程的方案与现有技术的方案相比，由于其活性蛋白变多，在后续的二氧化硅的制备

过程中获得了非常好的促进作用。

[0048] 步骤2：类弹性蛋白多肽ELP40介导二氧化硅粒子沉淀，获得仿生二氧化硅纳米粒子；具体包括如下过程：

[0049] 将步骤1得到的类弹性蛋白多肽ELP40溶解于PBS缓冲液得到ELP40溶液，浓度为100μmol/L，pH＝7；

[0050] 取10μL的1mmol/L溶解于盐酸的TMOS制成硅源溶液；同时，本申请还对硅源溶液进行改进，具体制备方法如下：配制离散石墨溶液：将质量为0.2g的石墨溶于浓度为1mmol/L

的盐酸中，定容至10mL，然后进行超声共混获得离散石墨溶液；然后将上述制成的硅源溶液

和离散石墨溶液混合并高速搅拌30分钟，即可得到混合硅源溶液；其中混合硅源溶液可通

过如下过程获得：将石墨加入盐酸，进行超声搅拌预设时间(至少3小时)，得到悬浊液，然后

将悬浊液和硅源溶液快速(几秒内)混合，在35?60℃进行搅拌预设时间(一般要超过

30min)，即可得到混合硅源溶液；

[0051] 将ELP40溶液和混合硅源溶液(改进后的硅源溶液)混合，混合均匀后在室温下静置预设时间(5min)，高速离心(10,000rpm，离心3min)，收集二氧化硅沉淀；

[0052] 即可得到二氧化硅/ELP40复合材料，即仿生二氧化硅纳米粒子。[0053] 此外，混合硅源溶液由于加入了石墨，ELPs溶液与混合硅源溶液混合后获得的二氧化硅沉淀里面有石墨，为此，根据石墨导电而二氧化硅不导电，可通过配制电解液并通电

(在电解液中插入两个电极，用电源在两电极间加上一定的电压时，石墨被吸附至电极，然

后电解液的最终沉淀物即是仿生二氧化硅纳米粒子)，上述电解液的配制以及通电过程本

领域的技术人员可参阅相关材料获得，例如格拉斯通著，贾立德等译：《电化学概论》，科学

出版社，北京，1958。(S.Glasstone，AnlntroductiontoElectrochemistry，an

Nostrand，NewYork，1947.)，本文不再赘述。

[0054] 其中，石墨的空间结构是一种层状结构，在每一层中，每一个碳原子参与形成3个平面正六边形，通过将石墨的层状结构将SiO2的立体网状结构进行分散化，使其大大减少

团聚现象，因此当硅源溶液与ELPs溶液混合时，可实现充分混合，进而可获得规则的球形结

构的仿生二氧化硅纳米粒子。得到的仿生二氧化硅纳米粒子的尺寸为700nm至1000nm，仿生

二氧化硅纳米粒子中二氧化硅的质量百分比为10％?99％。同时，通过扫描电镜与透射电镜

观察二氧化硅粒子的大小和形貌，得到二氧化硅粒子呈规则的球形，粒子直径大小集中在

70nm至400nm之间。

[0055] 为了用于扫描电子显微镜和投射电镜分析，则需要将实验最终得到的二氧化硅/ELP40复合材料置于低温冷冻干燥12h，然后70℃真空干燥箱中干燥12h。ELP40介导形成的

二氧化硅粒子SEM分析参见图1所示，ELP40介导形成的二氧化硅粒子TEM分析参见图2a和图

2b所示，图2a中，二氧化硅粒子在型号为S4800的电子显微镜，以工作电压为5万伏，工作距

离为8.2mm，放大4万倍得到的TEM分析图，图2b是二氧化硅粒子在型号为S4800的电子显微

镜，以工作电压为5万伏，工作距离为8.5mm，放大1.3万倍得到的TEM分析图。

[0056] 此外，ELP40浓度对二氧化硅沉淀量的影响参见图3，当ELP40浓度为10μmol/L?100μmol/L之间时，二氧化硅沉淀量随着ELP40浓度的增加而增加。在这一浓度范围内，反应尚

未达到饱和状态。

[0057] 图4为溶液pH值对二氧化硅沉淀量的影响示意图，由图可知在pH为7.0的反应条件下，生成的二氧化硅沉淀量最多。因此，当pH为7.0时，是ELP40介导二氧化硅矿化的最适反

应pH值。

[0058] 图5为反应温度对二氧化硅沉淀量的影响示意图，当反应温度为45℃时，生成二氧化硅沉淀量最多。因此，当温度为45℃时，是ELP40介导二氧化硅矿化的最适反应温度。

[0059] 图6为反应时间对二氧化硅沉淀量的影响，由图可知，随着反应时间逐渐增加，当反应时间达到10min后，生成的二氧化硅沉淀量趋于稳定。因此，当反应时间设为10min时，

能够得到较好的反应结果，同时也能节省反应时间。

[0060] 图7为二氧化硅粒子中释放的ELP40SDS?PAGE分析，图中泳道1是介导二氧化硅沉积之前的ELP40，泳道2是利用氢氧化钠溶解二氧化硅而释放出来的ELP40，可以看出EL40P

的分子量在介导二氧化硅形成的前后没有发生变化。此外，ELP40在反应前后都能保留其相

变的性质，因此，ELP40?二氧化硅杂化材料比传统的化学或者生物法合成的二氧化硅或许

有更为广阔的应用前景。从图中，还可以看出EL40P在反应的过程同时被包埋在二氧化硅粒

子里面。因此，在这一反应过程中，二氧化硅的形成和ELP的固定化是同步进行并完成的。综

上所述，ELP40既是催化二氧化硅的形成的催化剂，其本身又被包埋固定在自己催化形成的

二氧化硅载体上。该反应过程既是二氧化硅形成的过程，又是ELP40自催化固定化的过程。

该反应条件温和、设备简单、操作方便、容易达到工业化规模，具有重要的工业应用价值和

巨大的应用潜力。工业上，可以应用于固定化酶领域；生物医学方面，可以作为良好的药物

载体，尤其是缓释药物。

[0061] 此外，在实验条件下，并不是离散石墨溶液中石墨的质量越高最后获得的二氧化?3

硅粒子的粒子越多、形态越好，石墨的质量百分比浓度ω，ω＝质量e*10 /12*v，(石墨的摩

尔质量为12g/mol，离散石墨溶液体积质量浓度＝(石墨的摩尔质量×mmol/1000)/l＝g/

l)，v为离散石墨溶液的体积，单位为mL，通过对实验数据进行拟合，得到石墨的质量百分比

浓度ω优选为3wt％?3.7wt％，5.5e＜c＜7e，c为SiO2前体(TMOS)的质量。

[0062] 本申请通过上述步骤在不同条件下实验ELP40仿生矿化形成二氧化硅的产量与粒子大小形貌的关系，结果表明：ELP40介导二氧化硅矿化的最适反应pH是7.0，最适反应温度

为45℃，二氧化硅沉淀量随着ELP40浓度的增加而增加，当反应时间达到10min后生成的二

氧化硅沉淀量趋于稳定。ELP40介导形成的二氧化硅粒子为规则的球形，直径为70?400nm。

[0063] 本实施例中的实验材料的获取方案罗列如下：[0064] A、菌种和质粒均为实验室构建保存。[0065] (1)菌种：大肠杆菌E.coliBL21(DE3)为基因表达的宿主菌。[0066] (2)质粒：pET?22b(+)?ELP40。[0067] B、主要实验试剂均为分析纯或市面所能买到的最高纯度。[0068] C、主要培养基配方[0069] C.1LB种子培养基[0070] LB培养基：Tryptone1.0g，YeastExtract0.5g，NaCl1.0g，蒸馏水100mL。[0071] C.2TB扩大培养基[0072] 培养基：Tryptone12.0g，YeastExtract24.0g，Glycerol4.5mL，NH4Cl3.0g，加蒸馏水900mL溶解，121℃高压灭菌20min；

[0073] 磷酸盐溶液：K2HPO4·12H2O16.43g，KH2PO42.31g，蒸馏水100mL；121℃高压灭菌20min；

[0074] 将上述两种灭菌的溶液冷却至室温，混合即为TB培养基。[0075] D、实验溶液配制[0076] (1)100mg/mL氨苄青霉素钠：称取氨苄青霉素钠1.00g，溶于ddH2O，定容至10mL，用0.22μm的滤膜过滤除菌，分装后，于?20℃保存。

[0077] (2)100mmol/L的IPTG：称取IPTG2.38g，溶于ddH2O，定容至100mL，用0.22μm的滤膜过滤除菌，分装后，于?20℃避光保存。

[0078] (3)缓冲液：[0079] IPBS缓冲液：[0080] A液(0.2mol/L磷酸氢二钠溶液)：称取Na2HPO4·12H2O71.64g，溶于蒸馏水中，定容至1000mL。

[0081] B液(0.2mol/L磷酸二氢钠溶液)：称取Na2HPO424.0g，溶于蒸馏水中，定容至1000mL。

[0082][0083] 表10.2mol/LPBS缓冲液[0084] 按表1比例混合A、B液，加等体积的蒸馏水即为0.1mol/L不同pH值的PBS缓冲溶液。[0085] II磷酸氢二钠?柠檬酸缓冲液：[0086] A液(0.2mol/LNa2HPO4)：称取Na2HPO4·12H2O71.64g，溶于去离子水中，定容至1000mL。

[0087] B液(0.1mol/L柠檬酸)：称取C6H8O7·H2O21.01g，溶于去离子水中，定容至1000mL。

[0088][0089][0090] 表20.1mol/L柠檬酸和0.2mol/L磷酸氢二钠缓冲液[0091] 按表2比例混合A、B液，即为不同pH的磷酸氢二钠?柠檬酸缓冲液。[0092] 配100mL的100μg/mL的二氧化硅的标准溶液：用移液枪取1000μg/mL的二氧化硅溶液10mL，用0.05M氢氧化钠溶液定容于100mL容量瓶。

[0093] 按表3，用移液枪将100μg/mL，然后0.05M氢氧化钠溶液定容10mL，配成不同浓度的二氧化硅溶液。

[0094][0095] 表3不同浓度的二氧化硅溶液[0096] (6)1mmol/L盐酸的配制：先配制浓度1mol/L，取8.6mL36％的盐酸加水、搅拌、定容至100mL。取1mL的1mmol/L盐酸，稀释，定容至100mL。

[0097] (7)1mol/L的硅酸溶液的配制：称取1.522g的四甲基硅烷(TMOS)，用1mmol/L的盐酸溶解，定容至10mL，得到新鲜配制的硅酸溶液，室温静置15min，即可直接作为硅源。硅酸

宜现配现用。

[0098] 此外，本申请关于实验材料的未尽事宜可参阅发明人同期发表(包括指导学生发表)的其他文章或论文来获得。

[0099] 本申请还提供一种使用上述制备方法制备的二氧化硅纳米粒子的应用。本申请制备的二氧化硅纳米粒子因其粒径均匀而集中，具有非常好的特性，可广泛应用于固定化酶

的载体，酶自固定化即是酶在一定条件下或者介质中自发形成不可溶状态酶的过程，例如

将ELP40与木聚糖酶融合表达，实现硅基的木聚糖酶的自固定化。再例如，仿生二氧化硅纳

米粒子作为的缓释药物的载体等等。

[0100] 应该强调，术语“包括/包含”在本文使用时指特征、要素、步骤或组件的存在，但并不排除一个或更多个其它特征、要素、步骤或组件的存在或附加。

[0101] 此外，本发明的方法不限于按照说明书中描述的时间顺序来执行，也可以按照其他的时间顺序地、并行地或独立地执行。因此，本说明书中描述的方法的执行顺序不对本发

明的技术范围构成限制。

[0102] 尽管上面已经通过对本发明的具体实施例的描述对本发明进行了披露，但是，应该理解，上述的所有实施例和示例均是示例性的，而非限制性的。本领域的技术人员可在所

附权利要求的精神和范围内设计对本发明的各种修改、改进或者等同物。这些修改、改进或

者等同物也应当被认为包括在本发明的保护范围内。