发明涉及一种基于近红外荧光分子与纳米微球标记的方法以及基于近红外荧光纳米微球的免疫层析定量检测试剂。本发明将近红外荧光与纳米微球连接，制备了基于近红外荧光纳米微球的免疫层析试纸条。在检测过程中，利用红外光扫描仪，采用近红外光分别扫描质控线和样品线，用质控线荧光强度校正检测线荧光强度后代入荧光分析仪中的标准曲线，即可分析检测标本中的待测物的浓度。与近红外荧光分子直接与检测分子连接相比，近红外荧光纳米微球免疫层析显著的提高了检测灵敏度，降低了背景荧光强度。该标记方法和试剂可以在微生物检测、食品安全检测、毒品检测以及危险化学品快速检测中应用。